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【Discovery Studio】短乳杆菌鸟氨酸转氨基淀粉酶酶学性质的定点突变研究
氨基甲酸乙酯(EC)自然存在于大多数发酵食品和饮料中，但对实验动物有致癌和致突变作用。尿素和瓜氨酸是氨基甲酸乙酯主要的前体物质，精氨酸脱亚胺酶(ADI)、鸟氨酸转氨基淀粉酶(OTC)和氨基甲酸激酶(CK)通过ADI途径参与代谢精氨酸形成瓜氨酸。氨酸转氨淀粉酶(OTC)通过催化瓜氨酸生成鸟氨酸和氨甲酰磷酸参与精氨酸的降解。文章旨在通过Discovery Studio软件对OTC酶进行指导改造，使之提高酶活性和热稳定性。
图1.乳酸菌精ADI途径
先将短乳杆菌氨酸转氨淀粉酶与瓜氨酸使用CDOCKER进行分子对接，对结合位点附近氨基酸进行丙氨酸扫描。
表1 丙氨酸扫描
再根据突变能量筛选出H140、Q143 和D236对其进行饱和突变，再次筛选出H140A, H140W, Q143A, Q143F, Q143W, Q143Y, D236A, D236W和D236R这9个虚拟突变体，通过定向突变试剂盒，将突变体序列插入pET28a载体进行表达并纯化。
表2 饱和突变
将表达的各突变体OTC酶液与瓜氨酸混合后置于不同的温度及pH环境下，以测的最佳反应温度和pH值。再通过T50值得测量来确定各突变体的热稳定性。将纯化的酶液置于不同乙醇浓度(0%、2.5%、5%、10%）的缓冲液中培养以监测其乙醇耐受性。
图2 各突变体的最适温度和pH
表3 OTC极其突变体的热稳定性
图3 OTC极其突变体的乙醇耐受性
本文以短乳杆菌OTC的氨基酸序列为基础，利用Discovery Studio软件构建突变文库。发现H140、Q143和D236位点的突变可能对酶的催化性能或热稳定性有一定的影响。结果表明，Q143W和H140A突变体的催化活性是野生型的2-3倍。最适温度由55℃降至35℃，最适pH变为8.5，比对照组降低2个单位。同时，Q143W和H140A表现出优异的耐酒精性，为其在葡萄酒发酵中的进一步应用提供了新的可能性。D236R的热稳定性得到了提高，T1/2和T50 10提高了1.4倍，比野生型酶提高了9.9℃。一个氨基酸的突变会影响OTC的酶学性质。预期定点突变将转化OTC以提高酶活性，同时增强热稳定性。
